HIV diagnostyka

Rozpoznawanie, profilaktyka i leczenie chorób wewnętrznych, choroby wieku starszego, choroby zakaźne, układu oddechowego, diabetologia, alergie.
admin. med.

HIV diagnostyka

Post autor: admin. med. »

Rozpoznawanie zakażenia wirusem HIV- zagadnienia diagnostyczne .
Dr n.med. Patryk Smoliński

Historia badań nad wynalezieniem testu diagnostycznego wykorzystywanego w rutynowej praktyce klinicznej sięga 1985 roku, kiedy to zespół badawczy kierowany przez prof. Roberta Gallo (NIH, Bethesda, USA) wynalazł test przesiewowy oparty na detekcji przeciwciał skierowanych przeciwko natywnym antygenom HIV (testy I generacji). Test ten -zważywszy na ogromne wówczas zapotrzebowanie- został w szybkim trybie zarejestrowany przez Amerykański Instytut ds. Żywności i Leków. Kolejne lata dzięki metodom inżynierii genetycznej zaowocowały unowocześnieniem sposobów oczyszczania antygenów, pozyskiwaniem rekombinantów antygenowych HIV (testy II i III generacji) oraz dalszym modyfikacjom, w efekcie pozwalającym na testowanie także w późnych okresach okna serologicznego (testy IV generacji).

Obecnie w użyciu pozostaje szereg testów, które z uwagi na różne spektrum czułości i swoistości podzielono na testy przesiewowe i testy potwierdzenia. Warto przypomnieć, iż zarówno czułość jak i swoistość testu są jego najistotniejszymi parametrami świadczącymi o liczbie wyników fałszywie dodatnich lub ujemnych. Stąd, testy bardziej czułe cechują się niższym odsetkiem wyników fałszywie ujemnych, a te- bardziej swoiste- niższą liczbą wyników fałszywie dodatnich 7. Biorąc pod uwagę te zależności-testy przesiewowe cechuje wysoka czułość i niższa swoistość, testy potwierdzenia zaś – wysoka swoistość, a niższa czułość. Z tego powodu test przesiewowy zawsze powinien być wykonywany jako pierwszy. Obecnie stosowane serologiczne testy diagnostyczne HIV – bez względu na ich rodzaj-cechują się pożądanie wysokimi parametrami czułości i swoistości, tj. na poziomie od 96 do ponad 99%. Najczęstsze przyczyny uzyskiwania błędnych wyników testów przedstawia tabela 1[1].

Tabela 1: Najczęstsze przyczyny wyników fałszywie dodatnich i – ujemnych testów przesiewowych HIV


Wyniki fałszywie dodatnie

Wyniki fałszywie ujemne
Szpiczak mnogi
Błędy techniczne (hemoliza, skrzep, aglutynacja)
Choroby autoimmunologiczne np. SLE, PBC
Szczepienie p/WZW B
Przeszczep organów
Malaria
Liczne porody
Przewlekła niewydolność nerek
Hemofilia
Współistniejące zakażenia wirusowe

Błędy techniczne
Okno serologiczne
Immunosupresja farmakologiczna
Nowotwory złośliwe


Zasady przeprowadzania i interpretacji testów
Zastosowanie odpowiedniego testu diagnostycznego, a zwłaszcza jego interpretacji- jest w dużej mierze zależne od dokładnej znajomości dynamiki odpowiedzi immunologicznej organizmu, czyli tzw. serokonwersji, na antygeny wirusa. Ma to szczególne znaczenie zwłaszcza podczas wczesnej fazy tzw. pierwotnego zakażenia HIV, kiedy zastosowanie testów przesiewowych opartych jedynie na wykrywaniu przeciwciał znajduje ograniczone zastosowanie. W naturalnej historii zakażenia HIV produkcja pierwszych przeciwciał anty-HIV Ig G (odpowiedź humoralna organizmu na zakażenie) przez organizm rozpoczyna się w ciągu kilku tygodni (zwykle 2-4) po ekspozycji. Dopiero po 12-24 tygodniach stwierdza się pełny obraz serologiczny swoistych przeciwciał anty-HIV. Najwcześniej- kilka dni po ekspozycji dochodzi do produkcji przeciwciał w klasie Ig M skierowanych przeciw antygenom rdzeniowym (gag) lub otoczki (env). W dalszym etapie pierwotnego zakażenia HIV wykrywa się obecność przeciwciał w klasie IgG , zwykle jednak nie później niż po 3 miesiącach od ekspozycji, których obecność wykorzystuje się w testach potwierdzenia, (rycina 1)[2]. Taka rozpiętość czasowa uzasadnia powtórzenie całej procedury badania po tym okresie we wszystkich przypadkach wątpliwych lub niejednoznacznych.
Najwcześniej ( w ciągu pierwszych tygodni po ekspozycji) i najłatwiej wykrywanym antygenem wirusowym w surowicy jest białko p24. , Przy udziale testów standardowych może być ono wykrywane jednak tylko w postaci wolnej. Z uwagi na następującą indukcję powstawania przeciwciał skierowanych przeciwko jego determinantom i tworzenia kompleksów immunologicznych, nie wykrywa się antygenu p24 po okresie serokonwersji, co ogranicza rutynowe metody jego wykrywania zasadniczo tylko do okna serologicznego . Podobne – choć odwrotne zjawisko- ma miejsce w późnym okresie zakażenia, kiedy to wysoka wiremia i przewaga wolnego antygenu w surowicy, ponownie pozwala na wykrycie jego obecności. Te zasady są główną podstawą współczesnych testów przesiewowych HIV, w których dodatkowo- obok przeciwciał- stwierdza się obecność antygenu HIV (testy typu combo, tzw. IV generacji), pozwalających rozpoznać zakażenie nawet w oknie serologicznym, 1-2 tyg po zakażeniu. Testy wykrywające antygen p24- obok współcześnie wykonywanych testów molekularnych (HIV RNA)- były jako pierwsze zalecane dla badania dawców krwi (Memorandum FDA, 1995 rok[3]).


Współczesna diagnostyka HIV
We współczesnej diagnostyce HIV wykorzystuje się zarówno testy wykrywające obecność przeciwciał anty-HIV, antygenu HIV jak również wirusowego materiału genetycznego (HIV RNA). Wykonywanie hodowli komórkowych nie znajduje zastosowania w rutynowej praktyce klinicznej. Serologiczne testy anty-HIV tzw. przesiewowe lub skriningowe oparte są na metodach immunoenzymatycznych (EIA-enzyme immunoassay lub ELISA- enzyme linked immunoabsorben assay). Testy potwierdzenia, będące w istocie również testami serologicznymi, wykrywają przeciwciała skierowane przeciwko różnym antygenom HIV i oparte są najczęściej na metodach elektroforetycznych typu Western Blot (rzadziej LIA-line immunoassay). Z uwagi na większą liczbę wykrywanych przeciciwciał anty-HIV, koniecznych dla uznania wyniku badania jako pozytywnego, testy Western Blot w porównaniu do EIA cechuje wyższa swoistość. Jednocześnie są one mniej czułe (względem testów III generacji EIA) , co uzasadnia wykonanie testu przesiewowego jako pierwszego lub weryfikację wyniku wykonaniem badania molekularnego (HIV RNA) . Interpretacja testów potwierdzenia uzależniana jest od liczby i typów stwierdzanych przeciwciał. Wynikiem pozytywnym testu określa się zwykle reaktywność (obecność prążków na błonie nitrocelulozowej) względem przeciwciał skierowanych przeciwko conajmniej dwóm białkom , produktów genów env, gag i/lub pol, przy czym wg kryteriów WHO zawsze muszą być stwierdzane przeciwciała przeciwko białkom env (np. gp 41, gp120, p24, p31-tabela 2 i 3) .Przy wykrywaniu niedostatecznej liczby prążków - test określa się jako niejednoznaczny[4]. Brak jakiejkolwiek reaktywności lub obecność prążków niesklasyfikowanych oznacza wynik ujemny.
Najczęstszymi przyczynami wyników niejednoznacznych i fałszywie dodatnich testów potwierdzenia należą: współzakażenie wirusowe, obecność przeciwciał heterofilnych przeciwko Ig G (np. mysie, owcze), przeciwmitochondrialnych lub jądrowych, wysoka bilirubinemia i błędy techniczne metody, w tym zanieczyszczenie surowicy [5], [6] . Możliwy jest również wynik niejednoznaczny w przypadku zakażenia wirusem HIV 2, podczas gdy stosowany test wykrywa swoiście tylko HIV 1 /konieczna zatem weryfikacja profilu diagnostycznego testu /.
Testy wprowadzane do rutynowej praktyki klinicznej wyróżniają się szeregiem cech, które warunkują ich wiarygodność i rzetelność wykazaną w różnych ośrodkach badawczych. Ich możliwości diagnostyczne i parametry muszą być miarodajne dla różnych wariantów HIV- HIV 1, 2, co potwierdza się wydaniem certyfikatów zgodności norm i zarejestrowaniem przez powołane do tego instytucje np. certyfikat CE, FDA-USA, Paul Ehrlich Instytut-Niemcy.
Obecnie coraz większe zastosowanie znajdują wymienione już testy IV generacji, które obok przeciwciał pozwalają na stwierdzenie obecności antygenu p24.

Testowanie wstępne uwzględnia wykonanie testów immunoenzymatycznych po uzyskaniu dwóch próbek surowicy z jednego pobrania krwi od pacjenta.
1.Ujemny wynik jest przekazywany pacjentowi lub lekarzowi, który skierował pacjenta na badanie. W przypadku podejrzenia uzyskania wyniku fałszywie ujemnego (np. okno serologiczne, choroba ogólnoustrojowa, ryzyko błędu technicznego) badanie przesiewowe należy powtórzyć zależnie od zaistniałych okoliczności. Przykładowo: podejrzenie pierwotnego zakażenia HIV skłania do wykonania badania powtórnego po 3 miesiącach, lub zastosowaniu testu z antygenem HIV czy badania molekularnego. W pozostałych przypadkach zaleca się powtórzenie badania po 2-4 tygodniach.
2.W przypadku wyniku pozytywnego pierwszej próby badanie należy powtórzyć z drugiej próby tego samego pobrania. Po uzyskaniu wyniku pozytywnego w teście przesiewowym należy przeprowadzić test potwierdzenia. Dodatni wynik testu potwierdzenia wraz z dwoma dodatnimi wynikami w testach przesiewowych pozwala na rozpoznanie zakażenia HIV.
3. Wynik wątpliwy na którymkolwiek etapie (testów przesiewowych lub potwierdzenia) wymaga powtórzenia całej procedury testowania od początku, czyli testu przesiewowego.
4.Brak potwierdzenia zakażenia HIV mimo pozytywnych wyników uzyskanych przy zastosowaniu testów enzymatycznych wykorzystujących także antygeny HIV (IV generacji) nasuwa podejrzenie okna serologicznego. Wówczas wskazane jest wykonanie badania molekularnego (HIV RNA).

* w przypadku wyniku nieokreślonego należy uwzględnić możliwość wyniku fałszywie ujemnego, użycie do kolejnego badania testu wykrywającego antygen p24 i/lub zastosowania metod molekularnych (HIV RNA), lub rozważyć powtórzenie testowania po 2-8 tyg,
** w uzasadnionych przypadkach należy badanie powtórzyć po 3-6 miesiącach /np. obserwacja po ekspozycji, objawy ostrej choroby retrowirusowej itp./

Skierowanie na test
Imienne bezpłatne badanie w kierunku HIV może zostać wykonane wyłącznie na podstawie skierowania wystawionego przez lekarza. Badanie odpłatne może być wykonywane anonimowo (np. na hasło) . Badania przeprowadzają uprawnione do tego ośrodki diagnostyczne.
Wynik
Wszelkie wyniki są wydawane lekarzowi kierującemu pacjenta na badanie z zachowaniem zasady poufności danych . Końcowy wynik dodatni testu wskazuje na konieczność ponownego pobrania krwi od pacjenta /tzw. drugie pobranie/. Wówczas przeprowadzany jest weryfikacyjny test immunoenzymatyczny (EIA). Podwójna procedura pozwala na uniknięcie pomyłki związanej z pobraniem krwi od pacjenta, zamiany probówek lub ich błędnym oznaczeniem.
Wyniki ujemne testów przesiewowych jako jedyne mogą być wydane bezpośrednio pacjentowi. Nie dopuszcza się informowania pacjentów o wynikach dodatnich lub wątpliwych testów przesiewowych, jak również związanych z nimi ewentualnymi następstwami. Ostateczny wynik- będący własnością pacjenta - zawsze powinien być czytelny i zrozumiały, a w razie potrzeby – szczegółowo omówiony przez uprawnione do tego osoby.

Znaczenie wczesnego rozpoznawania pierwotnego zakażenia HIV
Okres wczesnej fazy zakażenia HIV ma istotne znaczenie rokownicze. Okazuje się przykładowo , iż pacjenci manifestujący objawy ostrej choroby retrowirusowej (tzw. rzekomogrypowe) mają większe ryzyko progresji zakażenia w przyszłości. W ciągu 3 lat obserwacji wykazano bowiem blisko dwukrotnie większy spadek liczby komórek CR4 < 500 w porównaniu do osób bez objawów pierwotnego zakażenia HIV[8]. Wcześniejsze kwestie dotyczące włączania terapii we wczesnym okresie zakażenia HIV (tzw. pierwotne zakażenie HIV) zostały niedawno jednoznacznie wyjaśnione. Wykazano bowiem zarówno korzyści epidemiologiczne jak i rokownicze dla samego pacjenta po zastosowaniu określonej strategii postępowania . Wdrożenie terapii HAART (terapia antyretrowirusowa) w początkowej fazie zakażenia minimalizuje rozsiew wirusa za pośrednictwem komórek pamięci w organizmie i jego gromadzenie w rezerwuarach tkankowych. Według jednej z hipotez ich obecność warunkuje brak możliwość eradykacji HIV przez współcześnie stosowane leki . Szybka supresja wirusa przy udziale terapii zapobiega postępującej degradacji układu immunologicznego. Dodatkowo umożliwia ją względna homogenność szczepów wirusa na tym etapie zakażenia, minimalizując ryzyko selekcji szczepów lekoopornych. Rozpoczęcie terapii HAART w okresie zakażenia pierwotnego wydaje się zatem najbardziej optymalnym momentem tej strategii postępowania w naturalnym rozwoju zakażenia HIV.
Tym samym ważne jest zarówno jak najwcześniejsze rozpoznanie zakażenia HIV jak i określenie momentu przejścia zakażenia pierwotnego w fazę przewlekłą, gdy kończą się już optymalne warunku dla jej rozpoczęcia.
Rozpoznawanie infekcji HIV we wczesnych etapach jest jednak- ze względu na często skąpo- lub bezobjawowy przebieg- bardzo trudne. Także w objawowym okresie zakażenia pierwotnego – głównie z uwagi na niską czujność lekarzy pierwszego kontaktu - skierowanie zakażonego na test odbywa się rzadko[9].
Diagnostycznym dowodem fazy ostrej jest wykrywanie HIV RNA (kilka milionów kopii/ml) i białka p24 w ilościach rzędu 1-4 tys pg/ml. Oznaczenie HIV RNA metodą rozgałęzionego DNA (branched DNA)lub PCR cechuje wyższa czułość i nieznacznie niższa swoistość (odpowiednio ok. 100 i 96%) od testów wykrywających antygen p24 ( 77 i 99,5%)[10]. Po dokonanej serokonwersji antygen p24 jest wraz z neutralizynami związywany w kompleksy immunologiczne, co w efekcie uniemożliwia jego wykrycie przez szeroko stosowane testy komercyjne. Aktualnie, dzięki specjalnie „odczulonemu” testowi serologicznemu („detuned” EIA) możliwe jest retrospektywne obserwowanie momentu serokonwersji, co pozwala na podjęcie decyzji o rozpoczęciu terapii. O ile w przypadku standardowych testów serologicznych wynik pozytywny uzyskuje się po 4 -6 tyg ( zwykle do 3 miesięcy) od zakażenia, to „odczulenie” wydłużyło ten okres do 4 miesięcy. Zestawienie pozytywnego wyniku testu standardowego EIA i negatywnego „detuned EIA” pozwala z dużym przybliżeniem na stwierdzenie, iż do zakażenia doszło w ciągu ostatnich 6 miesięcy, co sugeruje pierwotne zakażenie HIV. Obecnie testy te są jednak wykorzystywane na potrzeby kontrolowanych badań klinicznych, zwłaszcza gdy istnieje potrzeba uzyskania laboratoryjnego dowodu pierwotnej fazy zakażenia u osób z grupy ryzyka czy tych z niespecyficznymi objawami dla ostrej choroby retrowirusowej[11]. Wykazanie fazy wczesnej zakażenia można również dokonać przy użyciu testów III i IV generacji. Wynik negatywny testu III generacji i pozytywny- IV generacji świadczyć może o obecności antygenu p24 w surowicy badanej, co przemawia za wczesną fazą zakażenia. Ostatecznie wynik ten należy potwierdzić jednak wykonaniem jakościowego badania molekularnego (HIV RNA)[12].

Badanie noworodków i niemowląt
Transmisja wertykalna i zakażenie okołoporodowe jest najczęstszym źródłem zakażeń HIV wśród dzieci i jej sumaryczne ryzyko sięga 30%. W każdym przypadku ciężarnej zakażonej HIV- nie leczonej dotychczas antyretrowirusowo- istnieją bezwzględne wskazania do stosowania profilaktyki antyHIV polegającej na podawaniu azydotymidyny od 14 tyg ciąży do 6 miesiąca po porodzie – zgodnie z zasadami protokołu ACTG 076. U pacjentek z niewykrywalnym HIV RNA zaleca się jej stosowanie nawet od 36 tyg ciąży [13]. Przestrzeganie zasad protokołu ACTG 076 pozwala na redukcję ryzyka zakażenia dziecka o 70%[14]. Dalsze postępowanie zależne jest do wyników badań diagnostycznych.
Z uwagi na przenikanie matczynych przeciwciał antyHIV w klasie IgG przez łożysko klasyczne testy serologiczne nie znajdują zastosowania w diagnostyce noworodków i niemowląt . Nie rozstrzyga bowiem o źródle pochodzenia przeciwciał. W tej grupie populacyjnej utrzymywanie się fałszywie dodatnich wyników testów potwierdzenia może trwać nawet powyżej 1 roku życia. Według zaleceń postępowania do rozpoznania infekcji HIV u dziecka poniżej 18 miesiąca życia matki zakażonej tym wirusem służy wykonanie którejkolwiek z niżej wymienionych metod diagnostycznych z surowicy dziecka:
- stwierdzenie HIV RNA metodą PCR
- wykazanie obecności antygenu p24
-dodatnia hodowla wirusa HIV.
Powyższe badanie należy powtórzyć przynajmniej dwukrotnie, przy czym najlepiej kilkoma ze wskazanych metod . Wykluczenie zakażenia HIV w tej grupie wiekowej odbywa się po uzyskaniu dwukrotnie ujemnych wyników badań wirusologicznych, przy czym pierwsze powinno być wykonane w wieku co najmniej 30 dni, drugie- po ukończeniu 3 miesiąca życia (optymalnie w pierwszej dobie życia, 4.-6. tyg i 4.-6 miesiącu życia)[15]. Uzyskanie dwóch negatywnych badań serologicznych powyżej 6 miesiąca życia dla klasy Ig G przeciwciał w odstępie przynajmniej 1 miesiąca badań również wyklucza takie zakażenie[16]. Czułość wymienionych metod rośnie wraz z wiekiem dziecka, przy czym najwyższe jej wskaźniki (> 95%) są osiągane po ukończeniu 4 tyg życia dziecka[17]. Najmniej czułe w tym okresie są metody oparte na oznaczaniu obecności antygenu p24 [18].

Punkty Konsultacyjno-Diagnostyczne
Odpowiednie poradnictwo przeprowadzane przez przeszkolony w tym celu personel (zwykle lekarski) jest nieodłącznym elementem ścieżki diagnostycznej HIV. Zarówno przed wykonaniem samego testu jak i po jego przeprowadzeniu, a szczególnie w przypadku uzyskania wyniku pozytywnego, pacjent powinien zostać szczegółowo poinformowany o znaczeniu tego badania, ewentualnych skutkach zakażenia i potencjalnych następstw społeczno-prawnych. W trakcie rozmowy pacjent powinien zostać szczegółowo poinformowany o wszelkich alternatywach postępowania związanych z rozpoznaniem zakażenia HIV. Ważne jest jego pouczenie o współczesnych możliwościach terapii przyczynowej, zarówno jej korzyściach jak i wadach. Szczegółowo powinno się omówić zasady zachowania w życiu codziennym, a zwłaszcza potencjalnym ryzyku epidemiologicznym dla osób postronnych, oraz okolicznościach, w których pacjenci mogą swobodnie funkcjonować i pracować bez ryzyka narażania osób postronnych . W naszej praktyce wielokrotnie spotykano osoby, które jeszcze przed uzyskaniem wyniku testu (zwykle ujemnego) uważały się za „niebezpieczne” dla otoczenia, nie wyobrażały sobie dalszego życia z rodziną w jednym gospodarstwie domowym, myślały o nadmiernych środkach higieny osobistej (np. korzystanie z oddzielnej toalety) czy swoistej autoizolacji z życia społecznego i rodzinnego. Dopiero ich szczegółowa edukacja (poradnictwo przedtestowe) pozwoliła na spokojne oczekiwanie na wynik testu. Poradnictwo potestowe w przypadku wyników ujemnych ma na celu pouczenie osób o powstrzymywaniu się od kolejnych zachowań ryzykownych, jeśli takie miały miejsce w przeszłości lub były powodem samodzielnego zgłoszenia się pacjenta na badanie. W przypadku wyniku dodatniego pacjent powinien zostać objęty swoistym wsparciem lekarsko-psychologicznym. Ma to na celu przekazanie informacji dotyczących dalszego życia pacjenta- szczególnie jego sfery społecznej, możliwości diagnostycznych, leczniczych oraz rokowniczych.
Źródło: Zakażenia 2005 nr 5; s.105-110
więcej:chorobyprzewodupokarmowego.pl
ODPOWIEDZ
  • Podobne tematy
    Odpowiedzi
    Odsłony
    Ostatni post