Zastosowanie metod fotodynamicznych w urologii

Choroby układu moczowo-płciowego, zaburzenia i potrzeby seksualne.
admin. med.

Zastosowanie metod fotodynamicznych w urologii

Post autor: admin. med. »

Diagnostyka fluorescencyjna należy do nowoczesnych metod diagnostycznych, w których analizowane są różnice fluorescencji tkanek zdrowych i zmienionych patologicznie. Rozróżnia się dwa typy tej diagnostyki: badanie autofluorescencyjne (LIF – laser induced fluorescence), oparte na analizie fluorescencji endogennych fluoroforów, oraz badanie fotodynamiczne (PDD – photodynamic diagnosis), w którym podaje się fotouczulacze. Związki te selektywnie gromadzą się w tkankach nowotworowych w większym stężeniu niż w tkankach prawidłowych. Stosuje się w tym celu wiele różnych związków (Photophrin II – pochodna porfirynowa, kwas deltaaminolewulinowy – ALA). Te metody diagnostyczne pozwalają na wczesne wykrywanie zmian nowotworowych.
Terapia fotodynamiczna jest selektywną metodą opartą na niszczeniu tkanek zawierających wysokie stężenia fotouczulacza. Metody fotodynamiczne – zarówno diagnostyka, jak i terapia – znalazły zastosowanie we wczesnych zmianach pęcherza moczowego.
W pracy przedstawiono aktualną wiedzę na temat zastosowania metod fotodynamicznych w urologii, uwzględniając doświadczenia własne autorów.

Wstęp

Wieloletnie badania pozwoliły na zastosowanie obrazowych metod spektroskopowych w diagnostyce i leczeniu zmian patologicznych u ludzi. Metody fotodynamiczne przyczyniły się do rozwoju optycznych sposobów diagnostyki zdrowych i zmienionych chorobowo tkanek. Diagno styka towarzyszyła początkowo terapii fotodynamicznej w celu ukazywania endogennych fotouczulaczy, ale szybko stała się mechanizmem biopsji optycznej - to jest rozpoznawania zmian patologicznych na podstawie nieprawid łowej fluorescencji widocznej w pomiarach spektroskopowych. Znaczny postęp technologiczny w optślektronice, coraz łatwiejsza obsługa i systematyczny spadek cen aparatury spowodowały duże zainteresowanie świata medycznego tymi metodami.

Spektroskopowe metody diagnostyki wykorzystują różnice we właściwościach optycznych tkanek zdrowych i zmienionych chorobowo. Zainteresowanie metodami fotodynamicznymi wynika z ich nieinwazyjnego charakteru, wyższej czułości i rozdzielczości w porównaniu z tradycyjnymi metodami diagnostycznymi (RM, TK, USG). Optyczne metody w przeciwieństwie do badań histopatologicznych i biochemicznych nie wymagają pobierania materiału tkankowego, ilość analizowanego materiału jest nielimitowana, promieniowanie doprowadzane i odbierane jest światłowodami, sygnały są odbierane i mierzone w czasie rzeczywistym, te same obszary można wielokrotnie analizować [1]. Potrzeba badań histopatologicznych jest bezdyskusyjna, niemniej lokalizacja pobranej próbki może być kontrolowana metodą nieinwazyjną.
Historia

Pierwsze doniesienia mówiące o fluorescencji tkanek przyniosły prace Raaba [2] i von Tappeinera [3], datowane są na rok 1900. Policard w 1924 r. opublikował swoje badania, w których opisuje fluorescencyjne właściwości porfiryn. Myśl tę rozwijają Auler i Banzer [4], omawiając w 1942 r. zjawisko fotodynamicznej aktywności porfiryn. Kilka lat później Figge i wsp. opisują wybiórcze gromadzenie fotouczulacza w guzie nowotworowym. Kontynuacja badań tej linii owocuje publikacją Schwartza z 1955 r., wykazującą lepsze gromadzenie się w tkankach nowotworowych pochodnych hematoporfiryny. W historii urologii znaczącą datą jest rok 1976: Kelly i Snell publikują pracę o rezultatach biopsji optycznej, tj. diagnostyki fluorescencyjnej in vitro raków przejściowokomórkowych pęcherza moczowego [5], z użyciem pochodnych hematoporfiryny. Procedura badawcza polegała na podaniu dożylnym hematoporfiryny w dawce 2 mg/kg 24 godziny przed planowaną cystektomią. Uzyskany materiał (pęcherz moczowy) obserwowano w świetle UV, stwierdzając patologiczną fluorescencję guzów ewidentnie egzofitycznych, zmian o charakterze dysplazji oraz raków in situ. Stosowany wówczas sprzęt optyczny nie pozwalał na detekcję fluorymetryczną in vivo, gdyż szklane soczewki endoskopów działały jak filtry widma emisyjnego.

W latach osiemdziesiątych nastąpił dynamiczny rozwój badań nad fotooptyką, którym towarzyszyły dalsze obserwacje laboratoryjne. Jocham i wsp. demonstrują w 1981 r. w świetle fluorescencyjnym wybiórczą akumulację pochodnych hematoporfiryny w obszarze zmian nowotworowych wszczepionych w ściany pęcherzy króliczych [6]. Pojawienie się systemu cystoskopowej detekcji optycznej, opracowanego przez Lina i wsp. [7], pozwoliło Baertowi i wsp. na dokładne różnicowanie zmian w pęcherzu moczowym [8]. Pionierem prac z dziedziny fluoroskopii jest prof. R. Alfano [9]. Pierwotnie wykorzystywano typowy spektrofluorymetr firmy Perkin-Elmer z wyprowadzonym światłowodem, co umożliwiało pomiary na zewnątrz przyrządu. Kolejne ulepszenia obejmowały wbudowywanie zamiast siatek dyspersyjnych specjalnych filtrów i algorytmów do wyznaczania względnych sygnałów emisji. Dotychczas zbudowano kilkadziesiąt układów diagnostycznych na świecie, wykorzystano różne techniki pomiaru widma i źródła światła (lampy rtęciowe, ksenonowe, lasery: helowo-kadmowy, helowo-neonowy, argonowy, kryptonowy, barwnikowy pompowany azotem). Jednym z pierwszych prostych fluorescencyjnych urządzeń dla metody PDT (photodynamic therapy - terapia fotodynamiczna) był zbudowany w Roswell Park fluorescencyjny fotometr (pierwszy klasyczny system diagnostyczny połączony z techniką endoskopową zbudowano w Centrum Onkologicznym w Tokio). Pomysł wielobarwnego obrazowania zrealizowała grupa prof. Svanberg. Dało to początek pomiarom autofluorescencyjnym. Obraz fluorescencyjny obszaru, otrzymany po wzbudzeniu tkanki, jest dzielony na cztery identyczne części w teleskopie i te po przejściu przez różne barwne filtry (np. 470 nm, 600 nm, 630 nm, 690 nm) przekazywane są do kamery CCD. Końcowy obraz jest kombinacją składowych barwnych odwzorowań tego samego obrazu.
Rak pęcherza moczowego

Rak przejściowokomórkowy (TCC - transitional cell cancer) pęcherza moczowego występuje w 95% wszystkich nowotworów pęcherza. Mimo egzofitycznego wzrostu i elektroresekcji obserwuje się 50-70% wznów miejscowych, ponadto 10-20% pacjentów notuje progresje choroby. Rutynowa diagnostyka obejmuje cystoskopię w świetle białym, badanie ultrasonograficzne pęcherza moczowego, urografię. Jednak płaskie, niewyróżniające się w świetle białym zmiany śluzówkowe pozostają łatwe do przeoczenia. Są to często dysplazje nabłonkowe wysokiego stopnia lub raki śródnabłonkowe (carcinoma in situ). Używając nowoczesnych metod diagnostycznych, takich jak diagnostyka fotodynamiczna czy badanie cytologiczne osadu moczu, urolodzy mogą wykryć nowotwór pęcherza we wczesnym stadium rozwoju [10,11,12,13,14,15,16,17,18].

TCC daje późne zmiany przerzutowe, gdyż wpierw nacieka całą grubość ściany pęcherza, zatem czas ten może być odpowiednio wykorzystany, jeśli diagnostyka będzie pełna na etapie wczesnych faz rozwoju raka [19].
Diagnostyka autofluorescencyjna

Wykorzystanie fluorymetrii różnicowej w systemie LIF (Laser Induced Fluorescence) pozwoliło na uniknięcie stosowania zewnętrznych fotouczulaczy i uczyniło diagnostykę całkowicie nieinwazyjną. Schemat składa się z lasera, np.: He-Cd (442 nm, 150 mW), dwóch kamer CCD sprzężonych ze wzmacniaczami obrazu i wyposażonych odpowiednio w filtr zielony i czerwony, komputera z kartami pamięci do rejestracji i obróbki obrazu oraz ramienia roboczego, tj. cystoskopu, bronchoskopu lub gastroskopu. Promieniowanie laserowe wprowadzane jest do kanału endoskopu, indukowana fluorescencja obszaru tkanki jest rejestrowana jednocześnie przez dwie kamery. Zielone i czerwone obrazy fluorescencyjne tego samego obszaru, otrzymane w tym samym czasie, są różnicowane i końcowy, barwny obraz zostaje odwzorowywany na monitorze. Obszary zielone są charakterystyczne dla tkanki zdrowej, czerwone dla tkanki patologicznej [20].

Fluorescencja w tkankach pochodzi między innymi od takich związków, jak endogenne porfiryny, melanina, beta- -karoten, kśnzymy NADH i FAD, białka zawarte w elastynie i kolagenie, pochodne pirydoksyny. Duży wpływ na obszar diagnozowany ma krew, która absorbuje światło wwidzialnym obszarze widma. Obszary zmienione nowotworowo niektórych narządów, np. płuc, pęcherza moczowego, żołądka, jelita, gardła, miąższu mózgu, mają znacznie obni- żone natężenia fluorescencji w zakresie niebiesko-zielonym.
Aparatura diagnostyczna

Wśród metod pomiarów fluorymetrycznych rozróżniamy badania spektralne, obrazowanie powierzchni i obrazowanie biochemiczne, będące połączeniem spektroskopii i obrazowania powierzchni. W metodzie spektralnej emisja światła zbierana z jednego punktu kierowana jest na monochromator z detektorem (fotopowielacz); ta metoda stosowana jest w spektrofluorymetrach. Zastępując powielacz zestawem detektorów (Linear Photodiode Array) kompletne widmo emisji otrzymuje się w tym samym czasie. Jest to obecnie najpopularniejszy wariant układów detekcji. Do obrazowania powierzchni detektorem jest czuła kamera CCD, połączona często ze wzmacniaczem obrazu. Zapis tego samego obrazu fluorescencyjnego odbywa się zwykle przy dwóch długościach fali, stosuje się wymianę filtrów na kamerze lub dwie kamery z nałożonymi filtrami. Idealnym rozwiązaniem dla analizy mieszaniny róż- nych barwników jest połączenie spektroskopii i obrazowania, układ składa się z elementu dyspersyjnego ciągu obrazowania. Każdy punkt powierzchni, zarejestrowany kamerą CCD, zawiera w sobie również widmo emisji otrzymane w tym samym czasie. Tworzy to nieograniczone możliwości diagnostyczne.
Diagnostyka fotodynamiczna

Historia diagnostyki fotodynamicznej (PDD - Photodynamic Diagnosis) zmian patologicznych m.in. pęcherza moczowego zaczyna się w latach sześćdziesiątych ubiegłego stulecia. Minęło wiele lat prób klinicznych i molekularnych, zanim zjawiska fotodynamiczne znalazły zastosowanie praktyczne. Bazują one na zasadzie selektywnego gromadzenia fotouczulaczy (np. Photofrinu) albo ich prekursorów (kwas deltaaminolewulinowy) w tkankach nowotworowych lub dysplastycznych i na poddawaniu ich dzia- łaniu światła laserowego przez światłowód z końcówką dwustożkową, umożliwiającą jednorodne oświetlenie pęcherza. Do rejestracji fluorescencji stosuje się kamerę CCD (charge-coupled device) z rozdzielczością 440 tys. pikseli, pracującą w systemie PAL.
Terapia fotodynamiczna

Stosowanie terapii fotodynamicznej zapoczątkowali Kelly i Snell w 1975 roku. Metodyka polega - jak już wcześniej wspomniano - na systemowym lub miejscowym podaniu fotouczulacza, następnie naświetlaniu danego obszaru celem wzbudzenia barwnika, co prowadzi do stymulacji procesu oksydacji powodującej martwicę tkanek, w których zgromadził się fotouczulacz. Terapia nie przynosi pełnego efektu tkankom niedotlenionym [21]. Obecnie w PDT miejscowo podaje się fotouczulacze w postaci wlewki dopęcherzowej lub aplikację systemową. Terapia fotodynamiczna najczęściej stosowana jest łącznie z innymi metodami leczenia, takimi jak przezcewkowa elektroresekcja (TUR-BT - transurethal electroresection of bladder tumor), wlewki chemioterapeutyku lub BCG, RTG-terapia. Połączenie TUR-BT z adjuwantową PDT daje tę samą efektywność (odsetek nawrotów 40-45%) co TUR-BT z BCG, przy niezmienionej liczbie i jakości skutków ubocznych. Do działań ubocznych stosowania fotouczulaczy w przypadku instylacji dopęcherzowych należą: parcia naglące, bóle podbrzusza, krwinkomocz, zmniejszenie u 16% pacjentów o połowę całkowitej pojemności pęcherza, rumień skórny u 19% pacjentów po ekspozycji na światło słoneczne.

Z uwagi na działanie uboczne fotouczulaczy we wlewie dopęcherzowym istnieje według Shackleya i wsp. możliwość jednoczasowego z fotouczulaczem podania lignokainy [22]. Obok efektu przeciwbólowego można też tym sposobem zwiększyć dawkę fotouczulacza, nie obserwując działań niepożądanych.
PDD a test BTA

Wczesna diagnostyka i ocena nawrotowości raków pęcherza moczowego dopuszcza stosowanie badania moczu testem IMMULITE NMP22, który w sposób ilościowy, w stabilizowanym moczu wykrywa białka matrycy jądrowej. Inną metodą diagnostyczną jest test BTA (Bladder Tumour Antigen). Lipiński i Jeromin [23] porównali ten test z PDD. Wyniki pracy mówią, iż w 81% przypadków chorych poddanych testowi uzyskano wyniki pozytywne, a diagnostyka fotodynamiczna potwierdziła rozpoznanie. Resekcja guzów wykazała u 17 pacjentów guza w stopniu zaawansowania TaG1-G2, u dwóch T1G2 i T1G3, Tis wystąpił u 14 pacjentów. W opisanej grupie pacjentów test BTA był negatywny u 19% pacjentów, mimo tego badanie PDD wykryło (a wynik histopatologiczny potwierdził) raka w stopniu zaawansowania klinicznego Tis (dwóch pacjentów) i TaG1 (jeden pacjent). W podsumowaniu autorzy zwracają uwagę na większą czułość PDD w stosunku do testu BTA.
FISH

Dual-color fluorescence in situ hybridization (FISH) jest nowoczesną metodą diagnostyki fluorescencyjnej. Po dopęcherzowej instylacji ALA wykonuje się cystoskopię, pobierając skrawki biopsyjne ze zmian o patologicznej fluorescencji. Doraźnie mrozi się je w suchym lodzie, barwi hematoksyliną i eozyną i dokonuje analizy genomu. Pierwsze tego typu badania przeprowadził Saper i wsp. [24]. Wczesne wyniki badań wykazują zmiany o charakterze delecji na obu ramionach chromosomu 9 u 90% pacjentów z rakiem pęcherza moczowego. Drugim odkryciem jest stwierdzenie inaktywacji genu supresorowego p53 u 70% pacjentów z rozpoznanym ca in situ, jak również carcinoma invasivum. Dotychczasowe wyniki badań są bardzo obiecujące. Ta linia badań podejmowana jest również w polskich ośrodkach (Ośrodek Diagnostyki i Terapii Laserowej Katedry i Kliniki Chorób Wewnętrznych, Angiologii i Medycyny Fizykalnej OEląskiej Akademii Medycznej w Bytomiu).
Doświadczenia własne

Metody fotodynamiczne w diagnostyce nowotworowej należą w wielu dziedzinach do postępowania standardowego. Ośrodek Diagnostyki Laserowej Katedry i Kliniki Chorób Wewnętrznych, Angiologii i Medycyny Fizykalnej w Bytomiu we współpracy ze Szpitalem Urologicznym im. Prof. Emila Michałowskiego w Katowicach, Oddziałem Urologii Szpitala Miejskiego Nr 1 w Bytomiu wykonał w grudniu zeszłego roku sześćsetny zabieg cystoskopii fluorescencyjnej. Na dorobek ośrodka składa się kilka tysięcy procedur fotodynamicznych. Na uwagę zasługują wyniki obserwacji 281 pacjentów z rozpoznanym rakiem przejściowokomórkowym pęcherza moczowego w stopniu zaawansowania pT1NoMo (cT1NxMx), którzy około trzy miesiące wcześniej przebyli przezcewkową elektroresekcję i u których nie obserwowano objawów wznowy lub obecności guza resztkowego w cystoskopii światła białego. Pacjenci ci zostali podzieleni na dwie grupy. 52 chorych poddano PDD, 229 chorych - diagnostyce autofluorescencyjnej. Każdorazowo pobierano do badania popłuczyny z pęcherza moczowego i wycinki z miejsc podejrzanych o patologię ściany pęcherza moczowego. Wyniki obserwacji mó- wią o 90,91% czułości w PDD vs. 97,83% w diagnostyce autofluorescencyjnej (LIF). Podobnie specyficzność PDD wynosi 66,60% vs. 70,07% dla LIF. Całkowita czułość i swoistość obu opisywanych metod wyniosła odpowiednio 96,49% i 69,46%. Nie obserwowano żadnych działań ubocznych związanych z podawaniem fotouczulacza lub instrumentacją w obrębie pęcherza moczowego.

Prowadzona obecnie obserwacja pacjentów po przebytej elektroresekcji raka przejściowokomórkowego pęcherza moczowego w stopniu zaawansowania pT1NoMo poddanych terapii fotodynamicznej z następowymi wlewkami BCG dowodzi wyższej skuteczności terapii łączonej (PDT + BCG) nad monoterapią (BCG lub PDT) w leczeniu TCC [25].

O zainteresowaniu opisywanymi metodami świadczy duża liczba zjazdów i konferencji o zasięgu międzynarodowym i światowym, poruszających tematykę kliniczną, jak i z zakresu badań podstawowych. W 2003 roku w Miyazaki (Japonia) odbył się OEwiatowy Zjazd Międzynarodowego Towarzystwa Fotodynamicznego. Ostatnim spotkaniem naukowym na terenie Europy było V Międzynarodowe Sympozjum Diagnostyki i Terapii Fotodynamicznej w Praktyce Klinicznej, zorganizowane w Bresanone. Na obu zjazdach znamiennie reprezentowane były prace kliniczne pochodzące z Polski, z których kilka zostało zakwalifikowanych do druku.

Przyszłość w diagnostyce fluorescencyjnej wydaje się należeć do spektroskopii ramanowskiej w zakresie bliskiej podczerwieni (NIR), metoda umożliwia ilościową analizę kolagenu, beta-karotenu, cholesterolu, gdyż te widma charakteryzują się dużą rozdzielczością. Metoda elastycznego rozproszenia wykorzystuje różnice w absorpcji, wielokrotnym odbiciu i rozproszeniu światła w dyfuzyjnych warstwach zdrowych i chorych tkanek, wkraczamy więc już w cytoarchitektonikę tkanek nowotworowych. Inną obiecującą metodą jest laserowa tomografia komputerowa, w której zamiast promieniowania gamma wzbudza się promieniowanie laserowe w zakresie NIR, charakteryzujące się największą znaną penetracją żywych tkanek.
ODPOWIEDZ
  • Podobne tematy
    Odpowiedzi
    Odsłony
    Ostatni post